氯化镧对大鼠局灶性脑缺血再灌注神经细胞凋亡的保护作用研究

【作者】 宋书欣；

【导师】 邓志锋；

【作者基本信息】 江西医学院 ， 外科学， 2003， 硕士

【摘要】 目的:　脑缺血是一种严重威胁人类生命健康的常见脑血管疾病，发病率占全部脑血管病的43%--65%。由于大脑神经元缺乏再生能力，缺血损伤导致神经元死亡造成神经功能缺损后即无法修复，后果严重。因此，寻找安全有效的治疗药物在缺血早期用药以阻断损伤级联反应，拯救梗塞灶周围缺血半暗带区处于死亡边缘的神经元便具有十分重要的意义。本实验旨在探讨氯化镧对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤导致的神经细胞凋亡是否且有抑制作用，从而为脑缺血的药物治疗探索新的思路。方法:　雄性SD大鼠（重250－270g）30只随机分成假手术组、缺血组、氯化镧治疗组。缺血组和氯化镧治疗组采用线栓法制成大鼠局灶性脑缺血2小时再灌注24小时动物模型。氯化镧治疗组于拔出栓线后按体重5mg∕kg的剂量经尾静脉给予氯化镧（浓度为1mg/ml），缺血组给予等体积生理盐水。假手术组操作基本同缺血组，仅插线深度为15 mm（尚未到达MCA起始部，由于脑底动脉环的存在，不至<WP=4>于造成缺血）。每组大鼠再灌注24小时后随机取5只在全麻下以4%的PBS甲醛灌注固定30分钟，取出脑，冠状位切取视交叉至视交叉后2mm厚脑组织块石蜡包埋。沿视交叉末端连续切取冠状3微米厚切片三张，一张进行HE染色，观察缺血侧脑组织病理改变；一张进行TUNEL染色，对缺血侧脑皮质缺血半暗带区凋亡细胞进行计数（400×光镜下每张切片随机选取皮层缺血半暗带区不重复5个视野进行凋亡细胞计数，结果取其均数）；另一张进行免疫组织化学抗Fas蛋白染色，对缺血侧脑皮质缺血半暗带区Fas蛋白表达阳性细胞进行计数（方法同TUNEL染色凋亡细胞计数）。另5只大鼠再灌注24小时后在全麻下取出脑，冠状位切取视交叉至视交叉后2mm厚脑组织块，分离缺血侧皮层及皮层下脑组织，对皮层及皮层下脑组织进行DNA提取并电泳；皮层脑组织同时采用二苯胺法测定DNA裂解率。结果:　1.HE染色:假手术组大鼠脑组织HE染色细胞胞浆呈红色，核呈蓝色，形态结构正常，细胞间质着色均匀。缺血组光镜下观察脑组织缺血区以尾壳核为中心并累及皮层，缺血中心区内可见部分细胞坏死，表现为稀疏红染区域内散在分布一些形态结构正常细胞及核固缩细胞，形态正常细胞与假手术组相同部位比较显著减少（部分细胞裂解坏死），但无明显成片坏死区。整个缺血区内均可见凋亡细胞，大量成簇出现的凋亡细胞主要分布在皮层，表现为细胞萎缩，核固缩，染色质凝聚呈致密浓染颗粒状，部分可见染色质凝聚在细胞核的核膜周边，其间少量散在分布形态完整的神经细胞，细胞间质着色较淡（缺血再灌注后间质水肿故着色较淡）。氯化镧治疗组与缺血组<WP=5>比较脑组织缺血范围无明显改变，凋亡细胞分布一致。但缺血组缺血中心区细胞坏死较氯化镧治疗组严重，光镜下表现为形态正常细胞更少。氯化镧治疗组皮层半暗带区分布大量凋亡细胞，但与缺血组比较氯化镧治疗组形态正常细胞更多，而凋亡细胞较少。2.DNA电泳：假手术组大鼠脑组织提取的DNA琼脂糖凝胶电泳显示位于凝胶样孔前方一较粗的条带；缺血组、氯化镧治疗组脑皮层组织（缺血半暗带区）提取的DNA琼脂糖凝胶电泳显示着色较深的DN A梯状条带；缺血组、氯化镧治疗组皮层下脑组织（缺血中心区）提取的DNA琼脂糖凝胶电泳显示弥散的、涂片状的显影。3.DNA裂解率测定：假手术组DNA裂解率：22.1%±1.5％；缺血组DNA裂解率：33.4%±1.3％；氯化镧治疗组DNA裂解率：28%±2.4％。缺血组、氯化镧治疗组DNA裂解率与假手术组比较显著升高， p<0.01；氯化镧治疗组DNA裂解率则明显低于缺血组，p<0.01。4.免疫组织化学抗Fas蛋白染色及Fas蛋白表达阳性细胞计数：假手术组极少见Fas蛋白表达阳性细胞。缺血组、氯化镧治疗组整个缺血区内均可见Fas蛋白表达阳性细胞，但在梗死灶中心区仅少量散在分布，大量成簇出现的Fas蛋白表达阳性细胞主要分布在皮层缺血半暗带区。Fas蛋白表达阳性细胞计数缺血组（72±9）与氯化镧治疗组（68±11）比较无显著差异，p＞0.01。5.TUNEL染色凋亡细胞计数：假手术组和缺血组、氯化镧治疗组健侧脑组织TUNEL染色只有零星的凋亡细胞（0－3）。缺血组和氯化镧治疗组缺血侧脑组织整个缺血区内均可见到凋亡细胞，但在梗死灶中心区（尾壳核）仅有少量散在分布的凋亡细胞，大<WP=6>量成簇出现的凋亡细胞主要分布在梗死灶边缘区（皮层）的内侧。氯化镧治疗组皮层缺血半暗带区凋亡细胞计数（140±13）与缺血组（170±9）比较，凋亡细胞数明显减少， p<0.01。　结论: 1.研究结果再次表明局灶性脑缺血再灌注缺血半暗带区神经细胞主要以凋亡的形式死亡。2.氯化镧对缺血再灌注诱导的神经细胞凋亡具有一定的抑制作用。更多还原