【作者】 邹国良；

【导师】 胡健；

【作者基本信息】 中国医科大学 ， 内科学， 2010， 博士

【摘要】 前言急性心肌梗死是严重危害人类健康的常见疾病,其根本解决方法就是尽快恢复心肌的血液供应。随着静脉溶栓术、经皮冠状动脉腔内成形术等技术的广泛应用,缺血心肌能够重新获得血液供应,明显减轻了缺血性心肌损伤。但是,再灌注过程往往加重组织细胞功能代谢障碍及结构破坏,引起致命性损伤,即缺血／再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI)。近年来,缺血后处理的心脏保护作用逐渐被人们重视,尽管作用机制仍在探讨之中,但其减轻I／RI的作用已经被广泛关注。作为一种内源性心脏保护机制,目前多个种系的动物实验已经证明PI3K/Akt信号通路参与了缺血后处理的心脏保护作用。现今,糖尿病已成为严重危害人类健康的全球流行性疾病,其持续增长的流行病学趋势已成为严重的公共卫生问题,其慢性并发症是患者致残、致死的主要原因。与非糖尿病人群相比,糖尿病人群中动脉粥样硬化性疾病的患病率高、发病年龄轻、病情进展较快,多脏器同时受累较多。糖尿病人群心脑血管病患病率为非糖尿病人群的2～3倍。本研究通过观察缺血后处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌梗死面积、心肌细胞凋亡指数的变化,系统评价其对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响；采用分子生物学的方法,观察缺血后处理对PI3K／Akt信号通路中的关键酶Akt及其下游调控的eNOS表达的影响,以探讨缺血后处理的心血管保护效应及其可能的分子机制,为缺血后处理广泛应用于临床提供理论依据。材料与方法一、实验材料12周龄雄性SD大鼠72只,购于哈尔滨医科大学实验动物中心。分组干预后取血,并采集心肌标本。TUNEL凋亡检测试剂盒、p-Akt、Akt单克隆抗体、p-eNOS、eNOS单克隆抗体购于上海碧云天生物制剂有限公司；β-actin单克隆抗体、RT-PCR试剂盒购于日本TakaRa公司。二、实验方法(一)缺血后处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响经尾静脉注射链脲佐菌素溶液(45mg／kg)制备糖尿病大鼠模型,采用随机区组设计将大鼠分为4组：正常组：正常饲养；假手术组：前降支下只穿线,不结扎；缺血再灌注组：结扎前降支30min,再灌注2h；缺血后处理组：结扎前降支30min,再灌注前行缺血30s,再灌注30s共3个循环,再灌注2h。检测各组大鼠CK-MB、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡指数。(二)PI3K／Akt信号通路在糖尿病大鼠缺血再灌注心肌中的调控作用在上述实验基础上增加缺血再灌注+渥曼青霉素组：结扎前降支30min,再灌注前5min经尾静脉注射渥曼青霉素(15μg／kg),再灌注2h；缺血后处理+渥曼青霉素组：结扎前降支30min,再灌注前5min经尾静脉注射渥曼青霉素(15μg/kg),再灌注前行缺血30s,再灌注30s共3个循环,再灌注2h。检测各组心肌梗死面积、心肌细胞凋亡指数。免疫组化技术检测各组大鼠心肌p-Akt, p-eNOS。RT-PCR方法检测各组大鼠心肌Akt,eNOS基因表达。Western blot方法检测各组大鼠心肌p-Akt, Akt, p-eNOS, eNOS蛋白表达。三、统计学处理采用SPSS16.0软件进行统计处理,各项观察指标均以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用SNK-q检验,以P<0.05作为有统计学意义的界值。实验结果一、缺血后处理对糖尿病大鼠心肌I／RI的影响缺血后处理组大鼠心肌梗死面积、心肌细胞凋亡指数与缺血再灌注组大鼠比较明显减小,血清CK-MB水平减低(P<0.05)；应用PI3K/Akt信号通路抑制剂渥曼青霉素后,缺血后处理组大鼠心肌梗死面积、心肌细胞凋亡指数、血清CK-MB水平增加,与缺血再灌注组比较差异无显著性(p>0.05)。二、各组大鼠心肌免疫组化染色p-Akt、p-eNOS的比较缺血后处理组大鼠心肌免疫组化显示p-Akt、p-eNOS表达水平高于缺血再灌注组,应用PI3K/Akt信号通路抑制剂渥曼青霉素后,缺血后处理组大鼠心肌p-Akt、p-eNOS表达水平减低,与缺血再灌注组比较差异无显著性(P>0.05)。三、Western blot检测各组大鼠心肌p-Akt/ Akt、p-eNOS/eNOS的比较缺血后处理组大鼠心肌p-Akt／Akt、p-eNOS／eNOS表达水平高于缺血再灌注组,应用PI3K／Akt信号通路抑制剂渥曼青霉素后,缺血后处理组大鼠心肌p-Akt／Akt、p-eNOS／eNOS表达水平减低,与缺血再灌注组比较差异无显著性(P>0.05)。四、RT-PCR检测各组大鼠心肌AktmRNA、eNOSmRNA的比较各组大鼠心肌AktmRNA、eNOSmRNA的表达比较无统计学意义(P>0.05)。结论缺血后处理可以减轻糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的梗死面积,减小凋亡指数,同时上调p-Akt、p-eNOS的表达,应用PI3K／Akt信号通路抑制剂渥曼青霉素后大鼠心肌p-Akt、p-eNOS的表达减少,同时缺血后处理的上述心脏保护作用消失,说明PI3K／Akt信号通路参与了缺血后处理对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保护作用。更多还原

【Abstract】 IntroductionCoronary heart disease is the main serious disease which is harmful to health, of them acute myocardial infarction (AMI) is the serious type. With the development of Intravenous thrombolysis、Percutaneous transluminal coronary angioplasty, ischemic myocardial injury was significantly reduced. But the reperfusion led to ischemia/reperfusion injury(I/RI). Ischemic postconditioning was proved to reduce I/RI through the PI3K/Akt pathway play a heart protective effect.Diabetes has become a serious disease to human health. Atherosclerosis was main chronic complication. However, the cardioprotective effect and mechanism of ischemic postconditioning on atherosclerosis have not been verifed.In the present experiment, we studied the effect on cardiovascular system and expression of Akt、eNOS in the heart of diabetic rats.Materials and methodsSD rats(12-week-old males) were randomly divided into 6 groops of 8 rats each, Diabetic model was induced by Streptozotozin (STZ,45mg/kg):normal; sham; IR IPostC; IR+wortmannin; IPostC+wortmannin. The effects of IPostC on I/RI were evaluated by infarct size, apoptotic index, and gene expression analysis(p-Akt, Akt, p-eNOS, eNOS protein and mRNA expression). Results1、IPostC can reduce infarct size, apoptotic index.2、IPostC can increase p-Akt, Akt, p-eNOS, eNOS protein and mRNA the expression.3、With the wortmannin, the inhibitor of PI3K/Akt pathway, IPostC can not reduce infarct size, apoptotic index and the expression of p-Akt, Akt, p-eNOS, eNOS protein and mRNA were lessened.ConclusionIPostC has the certain protective effects on I/RI of diabetic rats. Wortmannin reduced the protective effects of IPostC. So the effects of IPostC on I/RI of diabetic rats may be mediated by the PI3K/Akt pathway.更多还原