人类基因SEC14L3、ACAD10和BBS4v2的克隆与功能研究

【作者】 叶鑫；

【导师】 毛裕民；

【作者基本信息】 复旦大学 ， 遗传学， 2005， 博士

【摘要】 本实验室大规模的cDNA克隆与测序工作积累了大量的全长基因库。借助大量的生物信息学手段,我们试图从这些库中去筛选与重要的生理途径及人类疾病可能密切相关的基因进行研究。在此基础上我们筛选到了三条新基因并首次通过SCI期刊报道了各自的克隆与初步功能研究。这三条基因分别为SEC14L3、ACAD10和BBS4v2。 SEC14L3的cDNA全长2082bp,编码一个400个氨基酸的蛋白质。蛋白序列分析显示SEC14L3具有两个重要的功能结构域:CRAL-TRIO和GOLD结构域。信息学分析推测SEC14L3与SPF/TAP高度同源,可能为CRAL-TRIO蛋白家族的新成员。SPF/TAP在体内参与调节胆固醇合成与α生育酚代谢这两条重要的生理途径,提示SEC14L3可能具有类似的功能。组织表达谱分析显示SEC14L3主要在肝脏中表达,绿荧光融合蛋白表达显示其定位在细胞质内,初步实验表明α生育酚刺激不能引起与SPF/TAP类似的由胞质向细胞核的定位转移过程。三维结构模拟和氨基酸组成分析显示SEC14L3与SPF/TAP在疏水结合域存在关键氨基酸的差异和等电点的明显差异,提示两者之间在性质和功能上可能存在着差别。通过原核表达我们成功地分离得到了高纯度的SEC14L3蛋白CRAL-TRIO结构域部分的肽段,通过气相悬滴法对其进行了96种结晶条件的筛选,希望能够从晶体结构上对蛋白功能进行研究。 脂肪酸是人体内重要的能量物质,人体内40%左右的能量来源于脂肪酸β氧化过程。脂酰辅酶A脱氢酶正是脂肪酸β氧化过程的第一步氧化反应的催化酶。迄今发现了9类不同的脂酰辅酶A脱氢酶,在蛋白水平上都具有一个保守的脱氢酶结构域。在基因筛选过程中我们找到了一条新的脂酰辅酶A脱氢酶候选基因ACAD10。cDNA全长3960bp,编码一个1059个氨基酸长度的蛋白。序列分析与结构模拟显示其具有典型的脂酰辅酶A脱氢酶结构域,提示其作为脂酰辅酶A脱氢酶家族成员的可能性。除了这个结构域之外在靠N端具有两个相对较小的结构域:Hydrolase和APH,显示其功能上的特殊性,可能为一种多功能的蛋白质。为从结构上分析蛋白的功能,我们尝试了ACAD10及其同源蛋白LCAD、VLCAD和ACAD9的功能结构域的克隆与表达工作。 BBS4v2是我们在筛选过程中发现的一条与巴-比氏综合症可能相关的新基因,全长2530bp,编码一个527个氨基酸的蛋白质。序列比对发现其为BBS4基因的一个不同的剪接形式,两者具有不同的第一个外显子导致不同的ORF及不同的5’非翻译序列。表达谱比较发现BBS4和BBS4v2都是广谱表达,但是更多还原

【Abstract】 A large full-length gene bank has been contructured through large-scale cDNA cloning and sequencing. With kinds of bioinformatical analysis, we try to select novel human genes that maybe related to crucial pathways or human diseases. Based on these works we selected three novel genes as SEC14L3, ACAD10 and BBS4v2 for further research.The cDNA sequece of SEC14L3 is 2082 base pairs in length with an open reading frame encoding a 400 amino acids protein. Analysis of protein sequece shows that SEC14L3 contains two important domains as CRAL-TRIO and GOLD. As SEC14L3 is highly homologous to human SPF/TAP, we think it maybe a new member of CRAL-TRIO protein family. The SPF/TAP can regulate the synthesization of cholesterol and the metabil metabolization of α -Tocophel in wVo.lt is predicted that SEC14L3 maybe have a similar function like SPF/TAP. Through pEGFP-fusion protein expression and tissue distrubition analysis, we find that SEC14L3 is a cytoplasmic protein and it mostly expressed in liver. We haven’t found the transfer from cytoplasm to nucleolus in the existence of biophysical concentration of α -tocophel compared to SPF/TAP. By simulation of protein structure and amino-acids analysis we find there are significant difference in the key amino acid and更多还原