【作者】 何旺；

【导师】 李鸣；

【作者基本信息】 北京大学 ， 泌尿外科， 2008， 硕士

【摘要】 背景及研究目的:由于生活和饮食习惯改变等原因,前列腺癌在我国的发病率呈上升趋势。晚期前列腺癌主要的治疗是内分泌治疗,但多数病人在经过12~18个月的内分泌治疗后转变成为激素非依赖性的前列腺癌,失去对去势治疗的敏感性。寻找前列腺癌新的基因治疗靶点是晚期前列腺癌治疗研究的一个重要方向。JAKs/STATs信号转导通路与细胞的增殖、分化和凋亡关系密切,STAT3是该通路的关键转录因子。活化的信号转导子和转录激活子3(STAT3)的蛋白抑制剂(Protein inhibitor of activated signal transducer and activator of transcription 3,PIAS3)是STAT3的特异蛋白抑制剂,通过与活化的STAT3结合而阻止后者与DNA结合,从而抑制STAT3的转录激活活性。近年的研究表明,PIAS3蛋白的异常表达与前列腺癌有关。我们通过构建PIAS3特异性发夹状RNA(shRNA)表达质粒,敲低人前列腺癌细胞系DU145细胞过表达的PIAS3蛋白,研究PIAS3敲低对前列腺癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法:构建PIAS3 shRNA表达质粒pSilencer4.1/PIAS3,应用脂质体LipofectamineTM2000作为转染介质,转染DU145细胞。细胞分为无关序列组和RNA干扰组,每组设3个复孔,分别转染阴性对照质粒和pSilencer4.1/PIAS3质粒。阴性对照质粒表达与已知人、鼠基因序列低同源性(即无关序列)shRNA。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后PIAS3 mRNA表达水平的变化,蛋白免疫印迹(Western)检测转染后PIAS3蛋白表达水平的变化。噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖状态,碘化丙锭(PI)细胞周期检测试剂盒流式细胞术分析细胞周期,磷脂结合蛋白V /碘化丙锭(Annexin V/PI)双标凋亡检测试剂盒流式细胞术检测细胞凋亡。结果:双向测序证实PIAS3 shRNA表达质粒构建成功。RNA干扰组细胞PIAS3 mRNA和蛋白质表达水平与无关序列组相比明显下降。MTT分析显示PIAS3敲低促进细胞增殖,并存在剂量-效应关系。流式细胞术分析显示:与无关序列组相比,RNA干扰组S期细胞比例增加,G0/G1期细胞比例减少,凋亡细胞比例减少。结论:PIAS3敲低促进前列腺癌细胞增殖,抑制其凋亡,PIAS3有可能可以成为前列腺癌的一个治疗靶点。更多还原

【Abstract】 Background and Objective Protein inhibitor of activated signal transducer and activator of transcription 3(PIAS3) is recently shown to play an important role in prostate carcinoma.We studied the effects of PIAS3 knocking down on proliferation, cell cycle and apoptosis of human prostate cancer cell line DU145.Methods PIAS3 specific short hairpin RNA(shRNA) expressing plasmid was constructed and named pSilencer4.1/PIAS3.DU145 cell was transfected with pSilencer4.1/PIAS3. The proliferation of DU145 cells was analyzed by MTT assay.Cell cycle and apoptosis of DU145 cells were analyzed by flowcytometry.Results PIAS3 shRNA expressing plasmid was constructed succefully,confirmed by sequencing.Expression of PIAS3 in DU145 was reduced significantly after pSilencer4.1/PIAS3 transfection. MTT assay shown accelerated proliferation after PIAS3 knocking down,and shown dose-effect curve. Flowcytometry shown cells in S phase increased,cells in G0/G1 decreased and percentage of apoptotic cells decreased after PIAS3 knocking down.Conclusion The knocking down of PIAS3 expression could accelerate DU145 cell proliferation and inhibit cell apoptosis.更多还原