【作者】 张帆；

【导师】 班睿；

【作者基本信息】 天津大学 ， 生物化工， 2006， 硕士

【摘要】 在枯草芽孢杆菌中,HPr蛋白既参与葡萄糖的跨膜运输,也参与碳分解代谢物阻遏作用(CCR)。己糖磷酸转移酶系统(PTS)是枯草芽孢杆菌主要的葡萄糖跨膜运输系统,HPr蛋白在15位组氨酸磷酸化,形成HPr-His15-P,作为磷酸基团由磷酸烯醇丙酮酸传递给酶Ⅱa的中间载体。同时,碳分解代谢物激活双功能的HPr激酶/HPr-Ser46-P磷酸酶(HprK/P)的激酶活性,HPr激酶催化HPr蛋白46位的丝氨酸磷酸化,形成HPr-Ser46-P,作为碳分解代谢物调节蛋白(CcpA)的辅助因子,与CcpA蛋白形成复合物,在细胞的CCR效应中,起主要的调控作用。重组枯草芽孢杆菌24A1是一株CcpA缺陷的核黄素生产菌株。由于CcpA的缺陷,破坏了细胞的碳分解代谢物调控机制,降低了葡萄糖所引起的CCR效应的强度,使核黄素发酵能够在高葡萄糖浓度下进行。但是,高浓度葡萄糖所引起的胞内碳分解代谢物水平的升高,仍然能够激活HPr激酶,使HPr蛋白46位丝氨酸被磷酸化。高浓度葡萄糖的存在使HPr激酶的活性持续存在,必然导致大部分HPr蛋白以HPr-Ser46-P的形式存在。非磷酸化的HPr的缺乏,可能会在一定程度上影响PTS系统的正常功能,降低细胞对葡萄糖的吸收速率。本文采用插入失活方法敲除了枯草芽孢杆菌24A1的hprK基因,构建了CcpA、HprK/P双缺陷的菌株B. subtilisZHc/pMX45。初步摇瓶发酵显示,B. subtilis ZHc/pMX45可以耐受12%的葡萄糖,与24A1/pMX45相比,在10%葡萄糖浓度下,核黄素积累量提高了19.2%,达到4.374mg/mL。更多还原

【Abstract】 In bacillus subtilis the HPr protein participate either in the glucose transportation,or in the carbon catabolite repression effect.the phosphoenol pyruvate:sugar phosphotransferase system (PEP-PTS) is the main glucose transportation system in B.subtilis.The HPr protein is phosphorylated at His-15 forming HPr-His15-P transferring phosphate group from HPr to EIIa.While HprK/P phosphorylate HPr at Ser46 forming HPr-Ser46-P as Co-effector of CcpA.The Knockout of CcpA gene increases the amount of FBP in vivo. And FBP could activate HPr kinase.So when CcpA is deleted, most part of the HPr will be phosphorylated at Ser-46. HPr-Ser46-P cannot participate in the transportation of glucose.Absorpton of glucose is blocked.In this study, obstacle of glucose absorption is relieved by disruption of hprk gene.The obtained B.subtilisZHc/pMX45 can tolerate glucose at the concentration of 12%.When the glucose concentration is 10%, production of riboflavin reaches the peak value of 4.374mg/ml, 19.2% higher than that of B.subtilis24A1/pMX45 at the glucose concentration of 8%.更多还原