【作者】 申华峰；

【导师】 任立群；

【作者基本信息】 吉林大学 ， 病理学与病理生理学， 2004， 硕士

【摘要】 心肌中纤维型胶原成份不成比例地增多称作心肌纤维化{cardiac fibrosis)。心肌纤维化临床表现多无特征性，主要造成难治性心衰及严重 的心律失常。 心脏间质中各种纤维及无定型物质，统称为心脏的细胞外基质 (ECM)。胶原是ECM中最丰富的结构成分。心肌间质胶原成分主要为I型及Ⅲ型胶原，I型胶原约占80％，Ⅲ型约12％。心肌成纤维细胞(CFbs)是合成心肌胶原的主要细胞。研究表明，CFbs能感受、结合机械性刺激并产生功能性应答，还可以合成I、III型胶原、蛋白胶原酶及其他细胞外基质成分。I型胶原以前胶原(procollagen)的形式释放到培养基质中。 儿茶酚胺(CA)对CFbs有很强的促增殖作用。去甲肾上腺素(NE)通过 激活肾上腺素能受体，导致心肌细胞肥大和CFbs增殖。NE可促进大鼠I型前胶原 1[I]链及转化生长因子- (TGF- 1)的mRNA表达增加。临床上给予心肌梗死病人硒(Se)和维生素E(VE)作为辅助治疗，能够促进心功能指标的改善。李保玉等发现，心肌损伤后心肌内胶原蛋白含量增加，并与低Se、低VE相关，补Se、补VE后，心肌胶原蛋白含量下降，说明体内低Se、低VE状态易促进心肌胶原过度蓄积。低Se、低VE造成体内脂质过氧化物增多，不但加重细胞损伤，同时促进前胶原羟化和胶原蛋白的交联，致使心肌内胶原过度蓄积。说明二者与心肌纤维化具有很重要的关系。 本研究通过体外培养CFbs，移入6孔和24孔培养板，加入0．4％小牛血清DMEM培养液、0．2g．μg／ml NE、不同浓度的Na2Seo3(0．05～0．2μg／ml)和VE(1～100μg／m1)，培养48小时后，收集细胞及上清。测定上清液中的HYP和I型胶原含量、CFbs中的醄I]型胶原mRNA的表 <WP=41>达，以确定Se和VE对胶原合成的作用情况。实验内容如下： 一、CFbs的培养与鉴定． (一)酶消化法体外培养CFbs，倒置显微镜下见贴壁的CFbs呈梭形，境界清楚，核透亮，随着细胞的增殖，2～3天细胞渐至亚融合及融合状态，此时行传代培养。实验用细胞为2～5代细胞。 (二)免疫组化法鉴定CFbs，S-ABC法对培养的CFbs进行波形蛋白单克隆抗体(virnentin)染色。染色结果：光镜下见胞浆围绕核周围呈现棕黄色反应，呈颗粒状，胞核不着色，阳性率达95％以上。 (三)透射电镜下见CFbs大小不等，细胞表面有较多的微绒毛，细胞质基质深染，线粒体小，胞质空泡增多，可见髓样小体以及粗面内质网扩张。 二、NE对I型CFbs胶原合成的影响： (一)NE对CFbs培养液I型胶原含量的影响 羟脯氨酸检测试剂盒测定培养液的羟脯氨酸(HYP)含量，间接EI,ISA．法测定I型胶原蛋白的含量。结果如下，0．2μg／ml NE作用48小时后上清中：HYP和I型胶原含量增加，与对照组比较有显著性差异(P<0．01)。