费氏中华根瘤菌的基因标记与竞争结瘤的研究

【作者】 刘桢付；

【导师】 周俊初；

【作者基本信息】 华中农业大学 ， 微生物学， 2001， 硕士

【摘要】 本研究以三亲本接合转移将含有发光酶基因luxAB的重组质粒pHN102导入费氏中华根瘤菌WWG18，得到标记菌株WWG18-lux。以同样的方法将含有绿荧光蛋白基因gfp的重组质粒pHN129导入费氏中华根瘤菌HNT29，得到另一标记菌株HN729-gfp。分别在自生和与大豆共尘条件下对标记菌株进行稳定性检测，结果表明：在两种条件下报告基因在标记菌株中遗传稳定性均为100％。 在砂培岔栽条件下，当供试菌株WWG18-lux与HNT29-gfp的体积比为100：1时，供试菌株从接种后第2天到第8天，WWG18-lux在根系的定殖密度高于HNT29-gfp，但是其接种后第11天到第32天，WWG18-lux在根系的定殖密度低于HNT29-gfp。当体积比为1：1时，供试菌株在接种后第2天，WWG18-lux在根系的定殖密度略高于HNT29-gfp，但是供试菌株从接种后第4天到第32天，WWG18-lux在根系的定殖密度始终低于HNT29-gfp。当体积比为1：100时，在接种后第2天到第32天，供试菌株WWG18-lux在根系的定殖密度始终低于HN729-gfp。占瘤率的检测结果表明：在三种不同体积比的条件下，HNT29-gfp的占瘤率始终明显高于WWG18-lux，表明HNT29-gfp的竞争结瘤能力高于WWG18-lux。砂培盆栽结瘤试验结果表明：占瘤率主要由菌株自身的竞争能力决定。根系定殖密度高的供试菌株的占瘤率高，占瘤率高的供试菌株的竞争结瘤能力强。接种量对占瘤率影响的结果表明：适当增大接种量能提高标记菌株的占瘤率。灭菌土培混合接种定殖密度测定结果表明：当体积比为100：1时，在接种后第2天到第16天，WWG18-lux在根系的定殖密度高于HNT29-gfp，在接种后第20天到第28天，其在根系的定殖密度低于HNT29-gfp。接种后第32天，其在根系的定殖密度高于HNT29-gfp。土培占瘤率的结果表明：HNT29-gfp的占瘤率高于WWG18-lux。灭菌土培混合接种时供试菌株的占瘤率高于非灭菌土培混合接种时的占瘤率。土培条件下结果表明：土壤中的其它因素（如：土著根瘤菌数量和土壤特性等）影响接种根瘤菌的竞争结瘤能力。供试菌株在土培和砂培时，其定殖密度变化不同。 用微根盒分根装置研究一侧根的结瘤对另一侧根结瘤影响的结果表明：用相同的菌株来接种根的左侧和右侧，在结瘤时期内，随着时间的延迟，一侧根的结瘤对另一侧根的结瘤有抑制作用。用竞争能力不同的标记菌株来接种根的左侧和右侧吋的结果表明：一侧根的结瘤对另一侧根的结瘤亦有抑制作用。本研究考察了（NH₄）₂SO₄对供试菌株结瘤的影响，结果表明：随着费氏中华根瘤菌基因标记与竞争结瘤的研究困H4)250。浓度的增加，总瘤数明显减少，1 omM倒H;)250;使供试菌株不结瘤。在倒H月)2504存在情况下，一侧根的结瘤对另一侧根结瘤影响的结果表明:不同浓度卿H4)2504存对根的两侧结瘤均有影响。随着倒H。)250;浓度的增加，与不加（NH;）2504时相比，一侧根的结瘤对另一侧根的结瘤抑制作用加强。10mM(NH刁2504使供试菌株两侧均不结瘤。更多还原

【Abstract】 Two plasmids. pHN102 with luxAB and pHN129 with gfp were transferred into Sinorhizobium fredii WWG18 and HNT29 by the method of tri-parental mating. Transconjugants WWG18-/wx and HNT29-g/p were obtained. The results of stability experiments showed that both luxAB and gfp could stablely inherit in marked strains in either free-living or symbiosis conditions by means of light emission detection.The results of competitive nodulation tests between the marked strains showed that the higher colonization density of the marked strain on the roots, the higher the ratio of nodule occupancy and the stronger competitive nodulation ability. The ratio of nodule occupancy of HNT29-g/p is higher than that of WWG18-lux and the ability of competitive nodulation of HNT29-gfp is stronger than that of WWG18-lux that proved the ratio of nodule occupancy was mainly determinated by the strain itself. The ratio of nodule occupancy could be increased according to the cell number of inoculated Sinorhizobium fredii.By using a self-designed split-root-system called Micro-rhizobox, it was demonstrated that the nodulation on one half-side root might suppress subsequent nodule formation on the opposite. Comparing with the results obtained from pot plant experiment using Fahraeus nitrogen-free plant grown solution, the total nodule numbers declined when chemical nitrogen was added. The suppression by different concentrations of (MH4)2SO4 on nodule formation was equal- in two sides, of roots. Suppression on nodule development from another side of a split-root system was enhanced with the increasement of (NH4)2SO4 concentrations When the (NH4)2SO4 concentration was increased to 10mM. the nodule could not be formed.更多还原