【作者】 胡良；

【导师】 王红阳；

【作者基本信息】 第二军医大学 ， 生物化学与分子生物学， 2009， 博士

【摘要】 第一部分Mcl-1参与HBx诱导细胞凋亡的作用机制研究研究背景和目的持续HBV感染是病毒引起的包括慢性肝炎、肝硬化等在内的慢性肝病的主要原因,并与肝细胞癌(HCC)的发生发展密切相关,在我国HBV感染是HCC最主要的病因。在HBV病毒所编码的蛋白中,HBx蛋白是HBV非结构基因编码的多功能病毒调控蛋白,参与HBV的感染、复制等一系列致病过程,并对肝细胞的增殖、凋亡、代谢、应激、迁移等多种生物学功能具有广泛而复杂的影响,被认为是HBV诱导肝癌发生过程中最主要的决定因素之一,而其确切致病机理仍有待进一步阐明。越来越多的证据表明凋亡是HBV病毒诱发慢性肝病的重要介质,相关研究发现HBx可以增强肝细胞对凋亡信号的敏感性。这些证据提示我们HBx可能通过促进肝细胞凋亡实现其诱发肝癌的作用,而HBx促进肝细胞凋亡的具体机制目前尚无定论。Bcl-2家族是细胞内调节凋亡与存活的最重要的一类蛋白家族,家族成员同时包括抗凋亡和促凋亡分子。其中Mcl-1(Myeloid cell leukemia-1),中文译为髓细胞淋巴瘤-1,是Bcl-2家族中重要的抗凋亡成员。目前发现Mcl-1广泛表达于各类组织细胞,参与胚胎发育、造血干细胞内稳态的维持,以及细胞凋亡的动态调控。但是,Mcl-1是否参与HBx诱导肝细胞凋亡并在其中发挥重要作用目前国内外均未见有系统报道。本研究从细胞和转基因动物水平观察HBx的表达对氧化应激信号诱导的肝细胞凋亡敏感性的影响,同时观察在此过程中Mcl-1表达水平的改变,明确HBx在何种水平、以何种方式调节Mcl-1的表达;再结合腺病毒介导的过表达技术,阐明Mcl-1在HBx诱导细胞凋亡中的作用;并结合临床HBV阳性肝癌患者的肝组织样本从组织水平明确HBx与Mcl-1表达的相关性。实验方法1.构建HBx和Mcl-1过表达及干扰质粒、包装表达HBx、Mcl-1和干扰Mcl-1的腺病毒、筛选建立HBx稳定细胞系;2.通过流式细胞技术观察瞬时表达和稳定表达HBx的细胞系对氧化应激信号敏感性的变化;3.通过双荧光素酶报告基因实验、RT-PCR和real-time PCR技术以及Westernblot方法分别观察表达HBx的细胞系在氧化应激信号暴露下对Mcl-1启动子转录活性、转录水平及其蛋白质水平的影响;4.使用通路特异性抑制剂实验开展HBx对Mcl-1表达调节的机制研究;5.运用荧光TUNEL法和流式细胞技术验证抑制相关信号通路和过表达Mcl-1在HBx诱导的细胞凋亡中的作用;6.建立HBx转基因小鼠肝氧化应激刺激模型,运用组织TUNEL、Western blot方法从体内水平验证HBx对Mcl-1蛋白水平及肝脏细胞凋亡的影响;7.免疫组化结合Western blot方法观察HBV阳性肝癌患者癌组织中HBx与Mcl-1表达的相关性。结果1.HBx明显增强细胞对氧化应激信号诱导凋亡的敏感性,在此过程中伴随Mcl-1蛋白水平的下调;且HBx能剂量依赖性的及时间依赖性的下调Mcl-1蛋白,并不受细胞系的影响;2.HBx下调Mcl-1蛋白主要发生在翻译后水平;3.过表达Mcl-1显著抑制HBx的促凋亡作用;4.HBx主要通过诱导细胞内ROS显著增加,激活caspas-3进而加速降解Mcl-1蛋白实现其促凋亡作用的;5.HBx转基因小鼠肝脏缺血再灌注处理后肝组织中Mcl-1蛋白水平下降,同时伴随肝细胞凋亡明显增加;6.HBV阳性肝癌患者癌组织中Mcl-1与HBx的表达水平存在负相关。结论本研究发现HBx增强肝细胞对氧化应激信号诱导凋亡的敏感性主要通过显著增加胞内ROS,活化caspas-3进而加速Mcl-1蛋白降解来实现。提示ROS/caspase-3/Mcl-1途径在HBx促肝细胞凋亡的过程中可能发挥重要作用。第二部分Mcl-1参与游离脂肪酸诱导细胞凋亡的作用机制研究研究背景和目的大量研究表明非酒精性脂肪肝是与肥胖、Ⅱ型糖尿病、高脂血症以及代谢综合征等疾病病程进展密切相关的代谢性疾病。近年来由于生活方式、饮食结构等的改变,非酒精性脂肪肝的发病率不断增加,目前已成为全世界范围内最常见的肝脏疾病,越来越受到人们的重视。然而,由于非酒精性脂肪肝的病因非常复杂,导致至今仍不清楚其确切的发病机制,因而也缺乏有效的治疗手段。游离脂肪酸是肝脏甘油三脂的主要来源,目前认为游离脂肪酸是引起肝脏脂毒性的重要介质,并在非酒精性脂肪肝的发病和病程进展中具有重要作用。研究发现,非酒精性脂肪肝病理学的重要特点是肝脏细胞凋亡显著增加。然而,对于游离脂肪酸如何诱导肝细胞发生凋亡的具体机制目前不十分清楚,仍有待进一步研究。近年来研究表明,Bcl-2家族中的Mcl-1作为其家族中一个重要的抗凋亡成员,在肝细胞的生存与凋亡的调控中发挥重要作用,然而Mcl-1是否参与游离脂肪酸诱导肝细胞凋亡并在其中发挥重要作用目前国内外未见相关报道。本实验首先观察游离脂肪酸诱导肝细胞凋亡过程中Mcl-1表达的改变,然后结合腺病毒介导的过表达及干扰技术,明确Mcl-1在游离脂肪酸诱导的细胞凋亡中的作用,并进一步阐明游离脂肪酸调节Mcl-1表达的分子机制。实验方法1.构建干扰Mcl-1的腺病毒;2.通过检测caspase活性和Western blot技术明确游离脂肪酸对凋亡的影响;3.Western blot实验检测游离脂肪酸诱导细胞凋亡过程中Mcl-1蛋白水平的改变;4.real-time PCR技术检测游离脂肪酸对Mcl-1转录水平的影响;5.运用腺病毒介导的过表达和干扰技术明确Mcl-1在游离脂肪酸诱导的细胞凋亡中的生物学功能;6.结合通路抑制剂实验开展游离脂肪酸对Mcl-1表达调控的信号通路研究。结果1.游离脂肪酸中的软脂酸可明显诱导肝细胞发生凋亡;2.软脂酸诱导的细胞凋亡过程中Mcl-1的蛋白水平显著下调;3.软脂酸诱导的肝细胞凋亡主要是由Mcl-1所介导的;4.软脂酸主要在翻译后水平促进Mcl-1蛋白通过泛素—蛋白酶体途径降解;5.抗氧化剂和caspase抑制剂均无法阻断软脂酸诱导的Mcl-1的下降;6.JNK通路介导软脂酸对Mcl-1的负向调节。结论本研究发现软脂酸诱导肝细胞凋亡过程中Mcl-1的蛋白水平显著下调,并进一步明确软脂酸诱导肝细胞凋亡主要是通过激活JNK通路、促进Mcl-1下调实现的,提示JNK/Mcl-1途径在软脂酸诱导的肝细胞脂性凋亡过程中具有重要作用。本研究为深入理解非酒精性脂肪肝发病机制提供新的线索,并为该病的治疗提供新的潜在靶点和策略。更多还原

【Abstract】 Background & Aims:Many studies provide strong evidence of the critical role of hepatitis B virus X(HBx) in human hepatocarcinogenesis.Although the association of HBx with apoptosis has been widely investigated,the exact role of HBx in modulating apoptotic process remains controversial.Here,we examined whether HBx exerts its apoptosis- promoting effects via dysregulation of Mcl-1 expression.Methods:Apoptotic cell death and the expression of Bcl-2 family proteins were determined in HBx-expressing hepatic cell lines and HBx transgenic mice. Immunohistochemistry and immunoblotting were performed to evaluate the expression of Mcl-1 in hepatocellular carcinoma(HCC) samples with or without hepatitis B virus(HBV) infection.Results:Ectopic expression of HBx rendered cell susceptible to death signals in response to cisplatin,which relied on the loss of Mcl-1.Caspase-3 inhibitors,but not JNK,P38,GSK-3βor proteasome inhibitors,effectively abrogated HBx-enhanced Mcl-1 degradation as well as cell apoptosis.Antioxidant treatment demonstrated that reactive oxygen species(ROS) triggered caspase-3-mediated Mcl-1 turnover in this model.Moreover,HBx sensitized cells to ROS-induced apoptotic killing also through activating caspase-3/Mcl-1 signaling.This pathway may be a general signal,as it was also observed in HBx transgenic mice in which HBx-primed Mcl-1 degradation and hepatocyte apoptosis were enhanced during liver ischemia/reperfusion(I/R),and was further supported by immunohistochemical and immunoblot data in HBV-related HCCs.Conclusions:We suggested that ROS/caspase-3/Mcl-1 pathway plays a dominant role in HBx-promoted cell apoptosis,which may shed a new light on the molecular mechanism of HBx-mediated hepatocarcinogenesis. Background & Aims:Non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD) is the most common liver disease and affects millions of people worldwide.Elevated serum free fatty acids(FFAs) and hepatocyte lipoapoptosis are features of non-alcoholic fatty liver disease.It is well established that free fatty acid(FFA)-induced lipotoxicity plays a pivotal role in the pathogenesis of NAFLD.However,the mechanism by which FFAs mediate lipoapoptosis remains unclear.Here,we explored whether the antiapoptotic Bcl-2 family member Mcl-1 plays a role in FFAs-mediated hepatocyte lipoapoptosis.Methods:Multiple hepatocyte cell lines were treated in culture with monounsaturated fatty acids and saturated fatty acids.Apoptotic cell death,caspase activity and the expression of antiapoptotic Bcl-2 family members were determined using Western blot and caspase activity assay.Results:Apoptosis was greater during exposure to palmitic acid versus oleic acid. Protein levels of Mcl-1,but not Bcl-xL or Bcl-2 were decreased during palmitic acid-induced apoptosis in a time-dependent manner.Mcl-1 overexpression dramatically prevented palmitic acid-induced apoptosis.Conversely,Mcl-1 downregulation further enhanced palmitic acid toxicity.Neither antioxidant nor pancaspase inhibitor was able to abrogated palmitic acid-enhanced Mcl-1 downregulation.Importantly,JNK activation was enhanced during exposure to palmitic acid and Inhibition of JNK,pharmacologically,effectively blocked hepatocyte lipoapoptosis triggered by palmitic acid.Conclusions:We suggested that JNK/Mcl-1 pathway plays a major role in palmitic acid-mediated hepatocyte lipoapoptosis,which may provide novel insights into the pathogenesis of NAFLD.更多还原