【作者】 刘木根；

【导师】 李昌本； 王擎；

【作者基本信息】 复旦大学 ， 遗传学， 2004， 博士

【摘要】 心血管疾病是最重要的人类疾病之一,在欧美发达国家和中国都是导致人类死亡的的头号杀手。对心血管疾病的分子遗传学研究,不仅可提供精确的诊断方法,发展新的有效的治疗手段,同时还有助于我们理解心脏工作和血管发育的机理。在本研究中,我们克隆了一个新的血管生成因子,VG5Q, 其突变可引起先天性静脉畸形骨肥大综合征(Klippel-Trenaunay Syndrome,以下简称 KTS);在一个大的长 QT 家系中,我们发现了一个新的 KCNQ1 基因的突变,L187P, 该突变引起这一家庭的部分成员患有呈常染色体显性遗传的长 QT 综合征。KTS 是一类先天性血管疾病,其症状是毛细血管、静脉管、淋巴管畸形,以及骨和软组织肥大,可影响到身体的许多部位,出现疼痛、残疾和畸形,给病人带来极大的痛苦和精神压力。KTS通常散发,其发病原因尚不清楚。 本文通过定位克隆的方法克隆了一个新基因 VG5Q,并研究了该基因在血管生成过程中的生理功能。我们在一位发生了 t(5;11)(q13.3;p15.1)平衡易位的 KTS 病人身上分离淋巴细胞,通过体细胞杂交,获得了含衍生 5 号染色体和衍生 11 号染色体的人-仓鼠杂种细胞株。用 PCR 我们得到了两条染色体的精确的易位断裂点,使得我们能鉴定其附近的 KTS 候选基因,结果在 5 号染色体上的断裂点附近,克隆了一个在血管细胞中高度表达的基因,我们将之命名为 VG5Q. 在发生平衡易位 t(5;11)的病人中,易位断裂发生在 VG5Q 上游的启动子区或调控区内,距 VG5Q 的转录起始点仅 1274bp,在人脐带静脉内皮细胞中,带有易位的 11 号染色体部分 DNA 序列的 VG5Q 启动子,较野生型的表达活性提高约三倍,提示这位 KTS 患者的染色体平衡易位是一种导致 VG5A 过度表达的遗传缺陷。对 130 位散发的 KTS病人,我们进行了 VG5Q 的全部编码序列的突变检测,结果发现在 5 位患者中,都发生了相同的第三外显子的第 133 位密码子的 G-A替换,这一突变引起带负电荷的谷氨酸为带正电荷的赖氨酸所取代。对 200 位正常对照的 SSCP 分析未能发现这一突变。应用鸡胚尿囊绒膜检测,我们发现纯化的细菌表达的 VG5Q 蛋白能强烈地促血管生成;与血管生成因子 VEGF 相似,在含 VG5Q 的玻璃纤维滤纸周围可见轮状的丰富的新生血管。我们还发现野生型和 E133K 突变型 VG5Q 的促血管生成作用存在着显著的差异,突变型蛋白具有更强的促血管生成功能。我们认为,VG5Q 是一个 KTS 的致病基因。其根据如下:1,KTS 病人的平衡易位发生在 VG5Q 的启动子区域,而易位可使得内皮细胞的 VG5Q 表达增强三倍。2, 在 130 位 KTS 病人的突变检测中,有五位患者具有 VG5Q 的 E133K 突变,而在 200位正常对照中,我们未发现这一变化。3,VG5Q 在血管细胞中高度表达,而 KTS 的最主要症状是血管畸形。4,和血管生成因子 VEGF 相同,VG5Q 可强烈促进血管生成。5,和野生型 VG5Q 相比,E133K 突变型的 VG5Q 具有更强的促血管生成作用,表明这一突变是一种功能增强型突变。6,在 11 号染色体的易位断裂点附近 100kb 的范围内,尚未有基因被发现。所有这些,加上文献报道 KTS 患者病变部位的毛细血管和静脉管增多,强有力地支持我们的结论:VG5Q 是一种新的血管生成因子,它是第一个被鉴定的 KTS 的致病基因。 1<WP=5>复旦大学博士论文 先天性静脉畸形骨肥大综合征和长 QT 综合征的分子遗传学研究 长QT综合征是指心电图上有QT间期延长、易产生室性心律失常,尤其是尖端扭转性室速,患者易发生晕厥和猝死的一类心脏病。我们对一个具有 5 代人的呈常染色体显性遗传的长 QT 家系进行研究,我们选用了五个与 6 种长 QT 基因紧密连锁的微卫星标记(D11S4046、D7S798、D3S1277、D4S402 和 D21S266)进行连锁分析,结果表明,该家系的致病基因与 LQT1 紧密连锁(Lod Score 为 6.11);对 KCNQ1 基因全部编码区的测序和 SSCP分析, 发现病人的第 187 号密码子发生T-C 的碱基替换,引起亮氨酸被脯氨酸取代的错义突变。SSCP和 RFLP 分析的结果,表明在此家系中,该突变与疾病共分离,而 200 位正常对照中则未发现该突变。 通过对该家系的基因诊断,发现在接受测试的 42 名成员中,31 位为突变基因的携带者,其中 26 位具有典型的 LQT1 的 ECGs 模式;18 位致病基因携带者具有正常或临界范围的 QTc(0.45±0.04 sec), 提示在这个 LQT1 家庭中,KCNQ1 基因中的 L187P 改变是一种外显率较低的遗传突变,而基因诊断对这类疾病的预防具有重要意义。更多还原

【Abstract】 Cardiovascular diseases are the No.1 killer in the United States, other developedcountries and China. The molecular genetic research on cardiovascular disease will notonly lead to development of accurate genetic testing and novel therapies forcardiovascular diseases, but also provide insights into molecular mechanisms underlyingthe development and function of the heart and blood vessels. In this study, we havecloned a novel angiogenic factor, VG5Q, as a candidate gene for Klippel-TrenaunaySyndrome; we also identified a novel mutation L187P of KCNQ1 gene, in a fivegeneration family with autosomal dominant LQTS. Klippel-Trenaunay Syndrome (OMIM *149000) is a congenital vascular diseasecharacterized by malformations of capillary, venous, and lymphatic vessels, with bonyand soft tissue hypertrophy. It affects many parts of the body, and is associated withsignificant morbidity with a profound impact on a patient’s life (e.g., pain, disability,disfigurement, and social stress). KTS is commonly sporadic, and its etiology isunknown. In this study, we used positional cloning to identify a novel gene, VG5Q, for KTS,and explore the physiological function of VG5Q in angiogenesis. A translocationt(5;11)(q13.3;p15.1) has previously been found to be associated with KTS. PCR analysiswith somatic cell hybrids containing only the derivative chromosome 5 or the derivativechromosome 11 defined the precise locations of two translocation breakpoints. It allowsus to identify KTS candidate gene, and a novel gene, named VG5Q (Vascular Gene on5q), close to the breakpoints on chromosome 5 has been identified. The 5q13.3translocation breakpoint is located in the promoter/regulatory region of VG5Q, and isonly 1274 bp upstream from the beginning of VG5Q cDNA. VG5Q promoter with thetranslocation junction fragment increased its expression by 3.0 fold in human umbilicalvein endothelial cells, suggests that the t (5; 11) translocation in the KTS patient is afunctional genetic defect that can lead to over-expression of VG5Q. We performed mutational analysis for VG5Q with 130 single KTS patients. Asingle non-conservative VG5Q mutation E133K was identified in five independent KTSpatients, and this mutation results in substitution of a negatively charged glutamineresidue for a positively charged lysine residue .Mutation E133K was not detected in 200normal subjects. With the chick chorioallantoic membrane (CAM) assay, we found that the purified,wild type VG5Q protein promoted strong angiogenesis as shown by the newly formed,radiated vessels on the CAM. Similar results were observed around the discs which werespotted with VEGF. Marked differences in angiogenesis were observed between wildtype and mutant VG5Q with the E133K substitution. Mutant VG5Q protein produced asignificantly more potent angiogenic factor than the wild type protein. 3<WP=7>复旦大学博士论文 先天性静脉畸形骨肥大综合征和长 QT 综合征的分子遗传学研究 Several lines of evidence strongly support the involvement of VG5Q in thepathogenesis of KTS: i) The KTS translocation breakpoint is located in the promoterregion of VG5Q, and the translocation increased expression of VG5Q by 3 fold inendothelial cells; ii) Mutation E133K of VG5Q was identified in five independentpatients, but not in 200 comparable controls; iii) VG5Q is highly expressed in bloodvessels; iv) VG5Q can cause angiogenesis (as potently as VEGF); v) Mutant VG5Qwith E133K causes greater angiogenesis than wild type VG5Q, establishing E133K as afunctional mutation that acts by a gain-of function mechanism; vi) No genes wereidentified at the chromosome 11p15.1 breakpoint (100 kb region). Together with thehistological finding of greatly increased numbers of capillary veins in affected tissuesfrom KTS patients, these results provide strong support for increased angiogenesis as themolecular pathogenic mechanism更多还原