【作者】 黄志强；

【导师】 王元和；

【作者基本信息】 第二军医大学 ， 外科学（普外）， 2001， 博士

【摘要】 单核／巨噬细胞是一类重要的免疫效应细胞，在人体抗肿瘤免疫中发挥重要作用。目前国外已有单核／巨噬细胞Ⅰ期临床试验的报道，而国内关于人体单核／巨噬细胞基础临床及动物实验方面的资料尚系空白。本实验以外周血为原料，首次观察了人体单核／巨噬细胞的体外分离、纯化、增殖、激活及体内体外抗肿瘤效应，比较了单核／巨噬细胞与LAK细胞的体内抗肿瘤活性差异，检测了单核／巨噬细胞培养上清中及细胞中TNF-α及IL-12的含量，并观察了单核／巨噬细胞培养上清对荷瘤小鼠的体内抗肿瘤效应。旨在对单核／巨噬细胞的抗肿瘤功能作一基础性研究，为今后单核／巨噬细胞的临床应用打下一定的理论基础。 实验方法：我们采用CS-3000 Plus血细胞分离机采集了7位肿瘤病人经化疗及G-CSF动员后的外周血单个核细胞，以密度梯度离心及贴壁法分离及纯化外周血单核细胞，以GM-CSF1000U／ml作单核／巨噬细胞对比增殖实验；以台盼蓝染色法检测细胞活率；以非特异性酯酶染色法鉴定单核细胞；以流式细胞技术检测单核／巨噬细胞表型以判断细胞分化程度；以透射电镜对培养8天单核／巨噬细胞进行形态学观察：以[’H]TdR掺合法检测单核／巨噬细胞对K562靶细胞的体外静止细胞毒活性；采用皮下预先注射的方法以观察激活巨噬细胞对接种K562靶细胞的生长抑制作用；采用瘤内注射法观察单核／巨噬细胞对菏瘤小鼠的体内抗肿瘤活性并与LAK细胞比较；采用Elisa法检测单核／巨噬细胞培养上清中TNF-α及IL-12的浓度；以Western-blot法检测单核／巨噬细胞中TNF-α及IL-12的含量；以激活巨噬细胞培养上清对菏瘤小鼠行腹腔注射观察细胞培养上清的体内抗肿瘤活性。 结果：1、采用CS-3000 Plus血细胞分离机可大量采集外周血中的单核细胞，在采血量为10000-12000ml时，平均每次单核细胞采集量为5.8×108[(0.83-11.75)×108]，其数量可满足实验要求。2、GM-CSF可刺激单核／ 第二军医大学 博士学位论文 巨噬细胞轻度增殖，单核／巨噬细胞经GM（sF刺激后可扩增5乃倍（P＜o．05人3、台盼蓝染色法证明培养第2天及第8天的单核l巨噬细胞活串均大于90％。4、非特异性酯酌染色显示外周血贴壁细胞胞浆广泛深染，并有棕褐色颗粒，证明贴壁细胞为单核细胞。5、流式细胞表型检测显示外周血贴壁细胞高表达＊D14抗原，培养吕天及经过1＊冲YO00＊偷1）和u9＊咖u联合刺激后大部分己经分化成熟。6、培养吕天的单核l巨噬细胞透射电镜观察显示胞浆内丰富的内质网、线粒体及溶酶体，显示细胞活跃的吞噬和分泌功能。7、单核／巨噬细胞体外静止细胞毒试验证明单核l巨噬细胞具有明显的抗肿瘤活性，其抗肿庙效应存在剂量一效应依赖关系，在效／靶比＝8：1 时其抗瘤活性达到最大值：！FN·丁a00＊八n1）和＊＊8山glinlm！）均可活化单核J巨噬细胞，增强其抗肿瘤活性（P功．05入 其对巨噬细胞的活化作用两者之间无显著差异 （P叩刀5hWNWN．可＋＊PS 联合刺激可进一步提高巨噬细胞抗肿瘤活性 （P＜o．01）。吕、激活巨喧细胞的预防注射可显著减少肿瘤的发生（P＜o．05）。9、单核／巨噬细胞及LAK细胞均有明显的体内抗肿盾活性，以微活巨噬细胞及活化LAK细胞瘤内注射的菏瘤小鼠组肿瘤平均面积及瘤重均显著小于对照组（P＜0刀1及P＜0刀5）：在同一效／M比条件下，激活巨噬纫胞抗肿鹰活性强于＊＊K细胞（P＜o．05）；病理切片显示巨噬细胞组庙结广泛坏死，残留肿瘤组织很少，伴弥漫性淋巴细胞浸润；LAK细胞组瘤结有轻到中度坏死，局部淋巴细胞浸润：而对照组瘤结肿瘤细胞呈旺盛生长态势，伴点状坏死，无淋巴细胞浸润。10、Elisa法测定细胞培养上清中 TNF a及 IL．12浓度显示LPS0ug／ml）可显著增强单核／巨噬细胞对WP山及IL12的分泌，LPS组细胞上清中TNF·Q及IL－12浓度显著高于对照组（P＜0．of及P＜0．05）。IFN．Y（200U／m）对单核／巨噬细胞的此种刺激作用不明显，但和LPS＊U咖l）有协同作用，可强烈刺激单核 l巨噬细胞分泌 iF a及 ILd，IFN·Ya00Ulml）＋LPSOuglml）联合处理组细胞上清中TNF a及IL12浓度显著高于对照组（P＜0．00）。11、Western．blot法测定单核l巨噬细胞中 hF．口及肌．12含量 4第二军医大学 博士学位论文同样显示LPS＊ug／ml）可显著刺激单核／巨噬细胞对该两细胞因子的合成，IFN－m仅00U／ml）单独刺激作用不明显，但和 LPS有协同作用，可明显提高细胞中TNF a及 IL－12的含量。12、激活巨噬细胞培养上清有明显抗肿瘤作用，腹腔注射激活巨噬细胞培养上清组小鼠瘤重显著小于对照组（P＜0刀5），生存时间显著高于对照组（P＜0刀5）。 结论：l、采用 CS－3000 PISS血细胞分离机可大量采集外周血中的单核细胞，为单核／巨噬细胞的实验研究提供了一条行之有效的细胞采集方法。二、GMcSF可刺激单核／巨噬细胞轻度增殖。3、单核／巨噬细胞具有明显的抗肿瘤效应。4、IFN－mC00U／ml）及 L更多还原

【Abstract】