【作者】 刘舒媛；

【导师】 褚嘉祐；

【作者基本信息】 北京协和医学院 ， 遗传学， 2011， 博士

【摘要】 全世界已婚孕龄夫妇存在生育困难的发病率高达10%-15%,男女因素大约各占50%。目前普遍认为精子功能缺陷是造成男性不育的最主要原因之一。精子活力是衡量精液质量和男性生育力的一项重要指标。炎症、免疫因素、理化因子等均会导致精子活力降低,其中能量障碍为一个重要原因,ATP是精子活力的首要能量来源,精子需要位于其尾部中段的线粒体氧化呼吸链提供ATP维持精子的活力和生育能力。线粒体DNA突变可影响ATP生成,从而直接或间接影响精子活力,进而引起精子发生障碍或弱精子症。DNA聚合酶γ(DNA po1ymerase gamma,polγ)是在mtDNA的复制和修复中起重要作用的核酶,并被认为是线粒体中唯一起聚合酶作用的酶。POLG基因的突变将会影响polγ的复制、校正活性,可能导致线粒体基因组的突变并最终影响ATP的产生。人类polγ在N端编码区出现CAG-三核苷酸重复序列,这个序列基因包含10个连串的编码Gln的CAG密码子。迄今为止,已发现POLG基因CAG-三核苷酸重复与人类疾病相关,如帕金森综合症、亨廷顿舞蹈症等,因此科学家们推测POLG基因区域的重复长度多态性可以作为评价基因在人类疾病中的作用的一个十分有用的标志。目前有很多关于POLG基因CAG-三核苷酸重复与男性不育相关性的研究,但是不同人群的研究得到的却是不一致的结果。因此,本课题研究中国人群男性不育与POLG基因CAG-三核苷酸重复的相关性,并试图得出男性不育与POLG基因CAG-三核苷酸重复相关性的确切结论。本课题同时开展中国不同群体POLG基因CAG-三核苷酸重复分布的检测和男性不育病例组和对照组POLG基因CAG-三核苷酸重复的关联性研究,然后运用Meta分析并结合得到的群体分布结果和病例-对照研究的数据,综合分析男性不育与POLG基因CAG-三核苷酸重复的相关性。一方面,我们对中国6个不同地区的汉族群体的健康个体进行POLG基因CAG-三核苷酸重复基因分型,以得到中国汉族人群POLG基因CAG-三核苷酸重复的分布情况,为男性不育与POLG基因CAG-三核苷酸重复相关性研究提供中国汉族人群的基因背景。同时对中国不同少数民族群体(独龙族、佤族、傈僳族、怒族、白族、撒拉族、藏族、土族、蒙古族和哈尼族爱伲人)的健康个体进行POLG基因CAG-三核苷酸重复基因分型,观察各民族群体中POLG基因CAG-三核苷酸重复的分布特点。另一方面,对367例少／弱精症男性不育患者和323例健康可育正常对照进行POLG基因CAG-三核苷酸重复基因分型,通过病例对照研究分析中国人群少/弱精症男性不育与POLG基因CAG-三核苷酸重复的相关性。最终,通过对比不同群体间POLG基因CAG-三核苷酸重复分布的差异,同时搜集现有报道的关于男性不育与POLG基因CAG-三核苷酸重复相关性的病例对照研究文献设计一个Meta分析,以综合评价POLG基因CAG-三核苷酸重复在男性不育发病中的作用,并分析各项研究间产生不一致结论的原因。我们的研究结果显示：中国各群体最普遍的POLG等位基因是(CAG)10,各群体间最主要的POLG基因型为10/10；6个不同地区的汉族群体最主要的突变基因型为10/11,各少数民族最主要的突变基因型为9/10和10/11；在所研究的6个汉族群体中均未发现有POLG基因突变纯合子(not10/not10),而在少数民族群体中检测到POLG基因突变纯合子(not10/not10):独龙族6/6、沧源佤族11/11。在6个不同地区的汉族群体中POLG基因CAG-等位基因频率和基因型频率分布差异没有统计学意义,但是汉族群体与独龙族、沧源佤族、哈尼族爱伲人、撒拉族、福贡怒族、西藏藏族和贡山怒族等群体的等位基因频率分布的差异均有统计学意义,研究的各少数民族群体间的等位基因频率分布差异也有统计学意义。在世界范围内比较发现,各不同种族、民族群体POLG基因CAG-三核苷酸重复的分布有显著差异。病例、对照组POLG基因CAG-三核苷酸重复等位基因的分型结果显示,正常对照组和男性不育组中最常见都是(CAG)10等位基因,频率分别为：病例组97.96%,对照组97.52%,POLG基因CAG-三核苷酸重复数在病例组中分布为7、9、10、11和12,对照组中的分布为9、10、11和13。男性不育组和正常对照组最主要的POLG基因型为10/10,该基因型频率分别为：病例组96.46%,对照组95.05%。统计结果显示：病例组和对照组POLG CAG-等位基因和基因型频率分布差异无统计学意义(P=0.588,OR=0.821,95％CI:0.403-1.675和P=0.357,OR=O.705.95％CI:0.334-1.488).我们的结果提示,中国人群男性不育与POLG基因CAG-三核苷酸重复不相关。基于我们的研究结果,我们搜集现有关于男性不育与POLG基因CAG-三核苷酸重复相关性的病例对照研究报道数据,构建了一个较为周密详尽的Meta分析。本次Meta分析纳入了包括本研究在内的10项相关研究文献,共计包含2680例男性不育病例和1677例正常对照,采用多种遗传比较模式(杂合子比较、纯合子比较、隐性遗传比较、显性遗传比较)对男性不育病例组和正常对照组间POLG基因CAG-三核苷酸重复的分布频率进行定量的综合分析。综合分析研究结果发现,男性不育与POLG基因CAG-三核苷酸重复没有相关性。我们的研究提示,POLG基因CAG-三核苷酸重复的分布在不同群体间存在较大的不同,中国汉族群体的(CAG)10等位基因频率和10/10基因型频率高于其它群体的频率分布,并且各群体间突变型等位基因和基因型的分布也有差异,我们研究的病例和对照组的频率分布与中国汉族群体的频率分布相符,但差异没有统计学意义。Meta分析显示,男性不育与POLG基因CAG-三核苷酸重复没有相关性。基于以上结果,我们推测,①不同群体间POLG基因CAG-三核苷酸重复分布的遗传背景差异影响着该群体与男性不育的相关性,②POLG基因CAG-三核苷酸的重复次数在不同群体可能有不同的变异范围,超出变异范围的重复次数可能导致疾病的发生,而并非所有变异的重复次数都与疾病的发生相关,③POLG基因CAG-三核苷酸的重复可能只是男性不育的一个微效基因,可能它与基因调控网络中的其它位点相互作用与男性不育相关。因此,我们提出,POLG基因CAG-三核苷酸的重复并不是男性不育易感性的关键位点。但是,鉴于polγ的重要功能,在今后的关于男性不育遗传相关性的研究可考虑从与POLG基因调控相关联的其它基因(如线粒体DNA等)入手,通过基因间的相互作用研究基因与男性不育的相关性。更多还原

【Abstract】 Male infertility is a multi-factorial syndrome encompassing a wide variety of disorders. Approximately 15 percent of couples are infertile, and among these couples, male factor infertility accounts for approximately 50 percent of causes. DNA polymerase y (POLG), which is encoded by the POLG gene, is the only known DNA polymerase for mtDNA replication and maintenance in human beings. The human POLG gene is located on 15q24-15q26, spans 23 exons, and includes a trinucleotide CAG-repeat region which encodes a polyglutamine stretch near the N-terminus of the mature protein and downstream of the presumed mitochondrial targeting sequence. It has been reported that human cDNA sequences contain 10 consecutive glutamines encoding CAG codons, followed by a single glutamine encoding a CAA codon, and two further CAG codons. Polyglutamine tracts can be sites of protein-protein interactions; altering the tract in POLG may result in suboptimal or improper mtDNA replication. To date over 150 disease mutations and 9 nonsynonymous polymorphisms in POLG have been found to be associated with autosomal recessive and dominant diseases.Meta-analysis is a statistical method of large collection of analysis results from individual studies for the purpose of integrating the findings. Meta-analysis enable us to report that the effect is robust across the kinds of populations sampled, and also to estimate the magnitude of the effect more precisely than we could with any of the studies alone.Several reports have implicated a association between the length of CAG-repeat in the polymerase y gene (pol y) and male infertility. However, such results have not been reproduced in other studies. In the present study, POLG-CAG repeat were analyzed in 535 healthy individuals from 6 Chinese Han populations living in different provinces. The frequencies of 10-CAG alleles and genotypes were 97.38% and 94.13%respectively; however, there was no significant difference among the 6 Chinese Han populations. We performed a pairwise comparison of different populations previously published on the frequency of the CAG-repeats genotype and found differences in the frequency of the three POLG CAG-repeats genotype between geographically-and ethnically-related populations. The prevalence of homozygous wild type (10/10) was shown to be exceedingly high in Chinese (97.38%). These results indicated that there is a significant difference in frequencies of the three CAG-repeat genotypes among different populations. Further, we determined the distribution of POLG-CAG repeat in 367 infertile men and 323 fertile men. Our study suggested that the distribution of POLG-CAG repeat alleles and genotypes were not significantly different between infertile (95.67%and 92.67%) and fertile men (97.22%and 94.44%). In a subsequent Meta-analysis combining our data with previous studies, a comparison of CAG-repeat alleles showed there was no obvious association with male infertility (pooled OR=0.94; 95%CI:0.60-1.48). The lack of significance appeared after combined genotypes with the following genetic models: homozygote comparison, heterozygote comparison, dominant model comparison, and recessive genetic comparison. In conclusion, the frequencies of POLG CAG-repeat variants are quite different in diverse ethnicities and this polymorphism may not be associated with Chinese male infertility. Based on a subsequent Meta-analysis, there was no obvious association between CAG-repeat variants of the POLG gene and male infertility.更多还原